Javascript è attualmente disabilitato nel tuo browser.Diverse funzionalità di questo sito non funzioneranno mentre javascript è disabilitato.accesso aperto alla ricerca scientifica e medicaDalla presentazione alla prima decisione editoriale.Dall'accettazione editoriale alla pubblicazione.La suddetta percentuale di manoscritti è stata respinta negli ultimi 12 mesi.Riviste scientifiche e mediche peer-reviewed ad accesso libero.Dove Medical Press è membro dell'OAI.Ristampe in blocco per l'industria farmaceutica.Offriamo vantaggi reali ai nostri autori, inclusa l'elaborazione accelerata degli articoli.Registra i tuoi dettagli specifici e farmaci specifici di interesse e abbineremo le informazioni fornite agli articoli dal nostro ampio database e ti invieremo prontamente copie PDF via e-mail.Torna a Diari » Progettazione, sviluppo e terapia di farmaci » Volume 16Autori Xie J, Zhang T, Li P, Wang D, Liu T, Xu SPubblicato l'11 settembre 2022 Volume 2022:16 Pagine 3071—3085DOI https://doi.org/10.2147/DDDT.S378786Revisione tramite revisione tra pari anonima singolaEditore che ha approvato la pubblicazione: Prof. Dr. Tin Wui WongJiangbo Xie,1,2 Tingting Zhang,3 Peichun Li,3 Dong Wang,2 Tao Liu,2 Shunliang Xu1 1Dipartimento di Neurologia, Secondo Ospedale, Cheeloo College of Medicine, Università di Shandong, Jinan, Repubblica Popolare Cinese;2Dipartimento di Neurologia, Weifang Traditional Chinese Hospital, Weifang, Repubblica Popolare Cinese;3Department of Rehabilitation Medicine, Weifang Traditional Chinese Hospital, Weifang, People's Republic of China Corrispondenza: Shunliang Xu, Department of Neurology, The Second Hospital, Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 247 Beiyuan Road, Jinan, Shandong, 250033, People's Republic of Cina, Tel +86 15153169998, Email [email protected] Sfondo: la diidromiricetina (DHM) esercita effetti protettivi in ​​varie malattie del cervello.Lo scopo di questa ricerca era di indagare il ruolo biologico del DHM nel danno da ischemia cerebrale da riperfusione (I/R).Metodi: Abbiamo generato un modello di ratto di lesione cerebrale I/R eseguendo l'occlusione/riperfusione dell'arteria cerebrale media (MCAO/R).È stato quindi valutato il punteggio neurologico e il contenuto di acqua nel cervello dei ratti sperimentali.Il volume dell'infarto e l'entità dell'apoptosi nei tessuti cerebrali sono stati quindi valutati mediante 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) e colorazione dell'etichettatura dell'estremità del nick (TUNEL) dUTP mediata da TdT.Le cellule neuronali dell'ippocampo (HT22) sono state sottoposte a deprivazione/riperfusione di ossigeno-glucosio (OGD/R) e sono state eseguite analisi del kit di conteggio cellulare-8 (CCK-8) e sono state eseguite citometria a flusso per rilevare la vitalità cellulare e l'apoptosi.Sono stati rilevati i livelli di specie lipidiche reattive dell'ossigeno (ROS) e ferro e sono stati valutati i livelli di espressione delle proteine ​​chiave mediante Western blotting.Risultati: il DHM ha ovviamente ridotto i deficit neurologici, il contenuto di acqua nel cervello, il volume dell'infarto e l'apoptosi cellulare nei tessuti cerebrali dei ratti MCAO/R.Il DHM ha represso la ferroptosi e ha inibito la via della sfingosina chinasi 1 (SPHK1)/mammifero della rapamicina (mTOR) nei ratti MCAO/R.Inoltre, il DHM ha promosso la vitalità cellulare e ha represso l'apoptosi nelle cellule HT22 trattate con OGD/R.Il DHM ha anche soppresso i livelli di ROS lipidico e ferro intracellulare nelle cellule HT22 trattate con OGD/R.I livelli di espressione della glutatione perossidasi 4 (GPX4) sono stati migliorati mentre i livelli di acil-CoA sintetasi membro della famiglia a catena lunga 4 (ACSL4) e proteina legante la fosfatidiletanolammina 1 (PEBP1) sono stati ridotti nelle cellule HT22 trattate con OGD/R in presenza di DHM.Inoltre, l'influenza conferita dal DHM è stata abrogata dalla sovraespressione di SPHK1 o dal trattamento con MHY1485 (un attivatore di mTOR).Conclusione: questa ricerca ha dimostrato che il DHM reprimeva la ferroptosi inibendo la via di segnalazione SPHK1/mTOR, alleviando così il danno cerebrale I/R.I nostri risultati suggeriscono che il DHM potrebbe essere un farmaco candidato per il trattamento delle lesioni cerebrali I/R.Abstract grafico: Parole chiave: diidromiricetina, ferroptosi, SPHK1, mTOR, danno da riperfusione da ischemia cerebraleL'ictus è la seconda causa di disabilità e morte nel mondo1 e comprende sia l'ictus ischemico che l'ictus emorragico.L'ictus ischemico, definito come infarto del cervello, della retina o del midollo spinale, si sviluppa in oltre l'85% di tutti gli ictus nel mondo.2 Come riportato in precedenza, l'incidenza dell'ictus è positivamente associata all'età del paziente;le stime mostrano che circa 13,7 milioni di individui soffrono di ictus ogni anno a livello globale.3,4 L'ictus crea un onere significativo per la salute fisica e mentale dei pazienti e anche per il sistema sanitario.Il rapido ripristino del flusso sanguigno (riperfusione) tramite trombectomia meccanica o trombolisi è il metodo principale utilizzato per ridurre o prevenire il danno neuronale nei pazienti con ictus ischemico.Paradossalmente, la riperfusione può aggravare i deficit neurologici o provocare danni aggiuntivi;questa condizione è definita come danno da riperfusione ischemica (I/R).5 Ricerche precedenti hanno mostrato che il danno cerebrale da I/R è il principale meccanismo fisiopatologico dell'ictus ischemico.6 La durata e la gravità del danno ischemico determina la reversibilità della risposta al tasso di sopravvivenza finale dei tessuti.7 Pertanto, lo sviluppo di metodi efficaci è particolarmente importante per il trattamento del danno cerebrale I/R.La ferroptosi, una via di morte cellulare causata da un'eccessiva perossidazione lipidica ferro-dipendente, è dominata dai sistemi antiossidanti e dall'ossidazione integrata.8 Il concetto di ferroptosi è stato descritto per la prima volta nel 2012 e si riferisce alla morte cellulare causata dall'erastina.La ferroptosi indotta dall'erastina si verifica principalmente inibendo l'antiporta cistina/glutammato (noto come sistema XC-) e una perdita dell'attività della glutatione perossidasi 4 (GPX4).Il sistema XC- può scambiare glutammato intracellulare e cistina extracellulare.La cistina intracellulare è essenziale per la sintesi del glutatione (GSH).9 Il membro 11 della famiglia di portatori di soluti 7 (SLC7A11) è la catena leggera del sistema XC.In precedenza è stato riportato che la downregulation di SLC7A11 alla fine provoca una riduzione della cistina intracellulare e il successivo esaurimento della sintesi di GSH.10 La riduzione della sintesi di GSH e la perdita dell'attività di GPX4 provocano danni al sistema di difesa antiossidante cellulare e portano all'accumulo di specie reattive dell'ossigeno (ROS), causando infine l'attivazione della ferroptosi.9,11 Numerosi studi hanno confermato che la ferroptosi è strettamente correlata a malattie del sistema nervoso, tra cui il morbo di Parkinson, il morbo di Alzheimer, il neurotrauma e l'ictus ischemico.12,13 Ferroptosi è stato rilevato anche nei tessuti cerebrali di modelli di ratto con ictus ischemico;la soppressione della ferroptosi da parte del giallo cartaminico ha portato a un'ovvia riduzione delle dimensioni dell'area dell'ictus e a un miglioramento del deficit neurologico in un modello di ratto di I/R, suggerendo così che l'inibizione della ferroptosi può alleviare efficacemente il danno cerebrale indotto da I/R. 14La diidromiricetina (DHM), un composto flavonoide ampiamente presente nel tè di vite (Ampelopsis grossedentata), ha proprietà antiossidanti, antinfiammatorie, anti-iperlipidemia e varie altre utili proprietà.15 Uno studio precedente ha scoperto che il DHM potrebbe migliorare il danno cerebrale nell'ictus ischemico.16 È stato anche dimostrato che il DHM protegge le cellule del neurone ippocampale del topo HT22 dallo stress ossidativo e dall'apoptosi indotti da privazione/riperfusione di ossigeno-glucosio (OGD/R) attivando il fattore nucleare E2 associato al fattore 2 (Nrf2)/eme ossigenasi-1 (HO- 1) via di segnalazione.16 Tuttavia, non è ancora stato chiarito se il DHM possa migliorare il danno cerebrale I/R in un modello animale.L'analisi bioinformatica dei potenziali bersagli del DHM ha rilevato che la sfingosina chinasi 1 (SPHK1) e il bersaglio della rapamicina nei mammiferi (mTOR) possono rappresentare bersagli del DHM.Il DHM può svolgere un ruolo protettivo nella lesione cerebrale I/R prendendo di mira SPHK1 e mTOR.Sulla base di ricerche pubblicate relative al danno cerebrale I/R, in precedenza abbiamo scoperto che la soppressione dell'espressione di SPHK1 e il miglioramento dell'inattivazione della segnalazione di mTOR aiutava ad attenuare il danno cerebrale indotto da I/R.17 Nella nefropatia diabetica, è stato dimostrato che il DHM allevia i reni fibrosi e inibisce la via di segnalazione di mTOR.18 Inoltre, la sovraespressione di SPHK1 promuove la fosforilazione di mTOR.19 L'eugenolo allevia il danno cerebrale I/R inibendo la via di segnalazione di mTOR, indicando così che l'inibizione della via di segnalazione di mTOR può ridurre la I cerebrale /R lesione.20 Pertanto, nel presente studio, abbiamo studiato se il DHM può reprimere la ferroptosi inibendo la via di segnalazione SPHK1/mTOR e quindi alleviare il danno cerebrale indotto da I/R.I ratti Sprague Dawley (SD) (maschio, 280 ± 20 g) sono stati forniti dal Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd (Pechino, Cina).I ratti sono stati alloggiati in condizioni specifiche esenti da agenti patogeni con temperatura controllata (26 ± 2°C) e umidità (55 ± 10%).Tutti i protocolli sono stati autorizzati dal Comitato Etico del Secondo Ospedale, Cheeloo College of Medicine, Università di Shandong (Riferimento: 2021SDL547).Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (Institute for Laboratory Animal Research, National Research Council, Washington, DC: National Academy Press, 1996).I ratti sono stati sottoposti a occlusione/riperfusione dell'arteria cerebrale media (MCAO/R) per indurre lesioni I/R come riportato in precedenza.21 I ratti sono stati anestetizzati con pentobarbital sodico alla dose di 40 mg/kg mediante iniezione intraperitoneale.I ratti sono stati prima ancorati su un tavolo operatorio in posizione supina.La pelliccia attorno all'incisione è stata rasata e quindi disinfettata.Successivamente, il collo di ciascun ratto è stato inciso al centro per esporre l'arteria carotide comune (CCA) destra, l'arteria carotide esterna (ECA) e l'arteria carotide interna (ICA).L'estremità prossimale dell'ACC e dell'ECA è stata legata e recisa utilizzando una sutura in nylon da 0,285 mm.La sutura è stata inserita dal moncone dell'ECA attraverso l'ICA per raggiungere l'MCA.L'MCA è stato quindi occluso per 2 ore per creare condizioni ischemiche.Successivamente, la sutura di nylon è stata estratta lentamente per ripristinare il flusso sanguigno e simulare la condizione di riperfusione.I ratti sono stati divisi casualmente in 6 gruppi (n = 5): controllo, sham, MCAO/R, L-DHM (DHM a basso dosaggio), M-DHM (DHM a dosaggio medio) e H-DHM (DHM ad alto dosaggio) .I gruppi MCAO/R, L-DHM, M-DHM e H-DHM hanno tutti ricevuto un intervento chirurgico MCAO/R;il gruppo di controllo non ha ricevuto alcun intervento chirurgico.I ratti nel gruppo sham hanno ricevuto lo stesso trattamento ed esposizione nell'area dell'arteria carotide comune ma senza MCAO/R.I gruppi di controllo, sham e MCAO/R hanno tutti ricevuto soluzione fisiologica normale.I restanti gruppi di intervento hanno ricevuto L-DHM (150 mg/kg), M-DHM (200 mg/kg) e H-DHM (250 mg/kg) per 7 giorni.I ratti sono stati somministrati con DHM mediante sonda gastrica prima di MCAO/R.Dopo la modellazione, è stato determinato il punteggio neurologico di ciascun ratto.Quindi, i ratti sono stati soppressi per lussazione cervicale.I tessuti cerebrali sono stati separati dai ratti e congelati in azoto liquido in attesa di analisi successive.Dopo la modellazione, il deficit neurologico di ciascun ratto è stato valutato in un punto 24 ore dopo l'ultimo trattamento farmacologico.Il punteggio neurologico è stato valutato con il metodo del punteggio Zea Longa in modo cieco.22 I punteggi Zea Longa sono classificati in cinque gradi, inclusa la prestazione normale, nessun deficit neurologico (0), le zampe anteriori controlaterali non possono estendersi completamente (1);girando sul lato opposto quando si cammina (2);cadere dal lato opposto quando si cammina (3) e nessuna deambulazione spontanea e perdita di coscienza (4).Per gli esperimenti di follow-up sono stati utilizzati ratti con un punteggio da 1 a 3.I ratti con un punteggio di 0 o 4 sono stati rimossi dall'analisi (insieme a quelli che sono morti).A un punto 24 ore dopo l'ultimo trattamento, abbiamo raccolto tessuto cerebrale da ciascun ratto.Il contenuto di acqua del cervello è stato quindi determinato con il metodo del peso secco.20 Le macchie di sangue sulla superficie dei tessuti cerebrali sono state accuratamente pulite con carta da filtro.Quindi, il peso umido dei tessuti cerebrali è stato determinato con una bilancia analitica.Successivamente, i tessuti cerebrali sono stati posti in una stufa ed essiccati a 105°C per 24 h;è stato quindi determinato il peso secco dei tessuti cerebrali.Contenuto d'acqua del cervello (%) = (peso a umido - peso a secco)/peso a umido ×100.A un punto 24 ore dopo l'ultimo trattamento farmacologico, è stata eseguita la colorazione TTC per stimare l'area dell'infarto in ciascun ratto.23 I tessuti cerebrali sono stati incorporati in un composto per la temperatura di taglio ottimale (OTC) e congelati a -20°C per 15 minuti;quindi, i tessuti sono stati tagliati in sezioni coronali di 2 mm.Le sezioni coronali sono state incubate con reagente colorante TTC al 2% a 37°C al buio.Dopo 20 minuti di incubazione, le sezioni sono state lavate con PBS per terminare la tintura e quindi fissate con paraformaldeide al 4% per 6 ore.Le aree non infartuate si colorano di rosso mentre le aree dell'infarto si colorano di bianco sporco.Le sezioni sono state fotografate con una fotocamera digitale e il volume dell'infarto e il volume del cervello sono stati determinati dal software Image-Pro Plus 6.0.La somma dell'area dell'infarto di ciascuna sezione era uguale al volume totale dell'infarto.Per ridurre al minimo l'errore indotto dall'edema, il volume dell'infarto è stato calcolato come segue: volume dell'infarto = regione dell'emisfero controlaterale - regione non infartuata nell'emisfero omolaterale.Percentuale di infarto (%) = volume dell'infarto/volume dell'emisfero controlaterale × 100.I tessuti cerebrali inclusi in paraffina sono stati sezionati con uno spessore di 5 µm.Le sezioni sono state colorate con Biotina-dUTP e Streptavidina-HRP dopo la deceratura e l'idratazione in conformità con il kit colorimetrico per il dosaggio dell'apoptosi dUTP Nick-End Labeling (TUNEL) mediato da TdT (Beyotime, Shanghai, Cina).20 Le sezioni sono state quindi colorate con diaminobenzidina.Le cellule TUNEL-positive (cellule apoptotiche) mostravano colorazione citoplasmatica e nuclei marroni.Le cellule apoptotiche sono state valutate con il software Image J.Le cellule neuronali dell'ippocampo (HT22; Zhong Qiao Xin Zhou Biotechnology Co., Ltd, Shanghai, Cina) sono state coltivate in Modified Eagle's Medium di Dulbecco (DMEM, Hyclone, Logan, UT, USA) a 37 ° C e 5% di CO2 in un'incubatrice.Il terreno è stato integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS, Hyclone) e l'1% di penicillina/streptomicina (Solarbio, Pechino, Cina).20Le cellule HT22 sono state somministrate con OGD/R per simulare la lesione cerebrale I/R in vitro.In breve, le cellule HT22 sono state coltivate in DMEM privo di glucosio e FBS in condizioni specifiche (37°C, 0,5% O2 e 5% CO2).Quindi, 12 ore dopo, le cellule sono state coltivate in condizioni di coltura normali per altre 24 ore.Le cellule HT22 sono state pretrattate con diverse concentrazioni di DHM (1, 10, 20 e 30 μM) per 24 ore prima del trattamento con OGD/R.Per indurre l'attivazione di mTOR, le cellule HT22 sono state trattate con 10 μM MHY1485 (un attivatore di mTOR; MedChem Express, Monmouth Junction, NJ, USA) per 24 h.24Per la sovraespressione di SPHK1, l'intera lunghezza del gene SPHK1 è stata subclonata nel vettore pcDNA3.1 per stabilire un pcDNA3.1-SPHK1 ricombinante.Specifico siRNA targeting GPX4 (si-GPX4) è stato utilizzato per silenziare il gene GPX4.Il vettore vuoto e il siRNA scramble (si-NC) sono serviti come controlli negativi (NC).Tutti i plasmidi sono stati acquistati da GeneChem (Shanghai, Cina).Le cellule sono state trasfettate con questi vettori o siRNA utilizzando il reagente di trasfezione Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).25 Le cellule trasfettate con successo sono state quindi raccolte per un ulteriore utilizzo.I livelli di espressione relativa delle proteine ​​sono stati determinati mediante Western blotting.26 La proteina totale è stata estratta dalle cellule HT22 e dai tessuti cerebrali con un kit di estrazione proteica totale (Solarbio) ed è stato utilizzato un kit di analisi delle proteine ​​dell'acido bicinconinico (BCA) (Solarbio) per determinare il concentrazione di proteine.Concentrazioni e volumi uguali di ciascun campione proteico sono stati quindi separati mediante elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide al 10% (SDS-PAGE).Successivamente, le proteine ​​separate sono state trasferite su membrane di nitrocellulosa.Le membrane sono state quindi incubate a 4°C per una notte con una gamma di anticorpi primari, inclusi anti-SPHK1 (1:2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), anti-mTOR (1:1000; Thermo Fisher Scientific), anti-p-mTOR (fosforilato mTOR; 1:2000; Thermo Fisher Scientific), anti-GPX4 (1:5000; Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-acil-CoA sintetasi a catena lunga membro della famiglia 4 (ACSL4) (1:10000; Abcam) o proteina legante l'antifosfatidiletanolammina 1 (PEBP1) (1:1000; Abcam).Successivamente, le membrane sono state incubate con anticorpo coniugato con perossidasi di rafano di capra e anticoniglio (1:2000; Abcam) a temperatura ambiente per 2 ore.L'anticorpo β-actina (1:5000; Abcam) è stato utilizzato come proteina di riferimento per la normalizzazione.Le bande proteiche sono state sviluppate dal reagente a chemiluminescenza potenziato (Beyotime) e i dati sono stati analizzati dal software Image J.I saggi del kit di conteggio cellulare-8 (Beyotime) sono stati utilizzati per valutare la vitalità delle cellule HT22.27 Le cellule HT22 sono state seminate in piastre da 96 pozzetti a una densità di 2000 cellule/100 μL e quindi sono state incubate con 10 μL di CCK-8 reagente a 37°C per 2 h.Infine, l'assorbanza delle cellule a 450 nm è stata rilevata utilizzando un lettore di micropiastre (Thermo Fisher Scientific).Abbiamo usato un kit di rilevamento dell'apoptosi dell'annessina V-fluoresceina 5-isotiocianato (Annexin V-FITC) (Beyotime) per rilevare l'apoptosi nelle cellule HT22.Le cellule HT22 sono state lavate più volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).Quindi, le cellule sono state incubate con 5 μL di annessina V-FITC e 10 μL di ioduro di propidio (PI) al buio a temperatura ambiente per 20 minuti.Le cellule apoptotiche sono state quindi rilevate utilizzando un citometro a flusso (ACEA Biosciences, San Diego, CA, USA).I livelli di ROS lipidico e ferro intracellulare sono stati rilevati con un kit per il dosaggio della malondialdeide di perossidazione lipidica (Sigma-Aldrich, Merck KGaA, Darmstadt, Germania) e un kit per il dosaggio del ferro (Sigma-Aldrich) secondo le istruzioni del produttore.28 L'assorbanza a 523 nm (per ROS lipidico) o 593 nm (per ferro intracellulare) sono stati quindi rilevati utilizzando uno spettrofotometro.Ciascun saggio è stato eseguito in triplicato.I dati sono espressi come media ± deviazione standard e il software GraphPad Prism 8.0 (La Jolla, CA, USA) è stato utilizzato per l'analisi statistica.Il test di Kruskal-Wallis seguito dal test di Dunn è stato utilizzato per confrontare le differenze nel punteggio neurologico tra i gruppi.L'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) seguita dal test post hoc di Tukey è stata utilizzata per analizzare le differenze statistiche tra più gruppi.P < 0,05 è stata considerata una differenza significativa.I ratti nei gruppi di controllo e sham non hanno mostrato deficit neurologici.In contrasto con i ratti nei gruppi di controllo e sham, quelli nel gruppo MCAO/R hanno mostrato evidenti deficit neurologici (** P <0,01), indicando così un grave danno neurologico.Gli effetti terapeutici del DHM sui deficit neurologici dei ratti MCAO/R erano dose-dipendenti (Figura 1A) (#P <0,05 e ##P <0,01 vs gruppo MCAO/R).Inoltre, rispetto ai ratti simulati, il contenuto di acqua nel cervello e il volume dell'infarto erano significativamente aumentati nei ratti dopo MCAO/R (** P <0,01).Il trattamento con L-DHM, M-DHM e H-DHM ha efficacemente ridotto il contenuto di acqua cerebrale e il volume dell'infarto cerebrale nei ratti MCAO/R in modo dose-dipendente (Figura 1B e C) (#P <0,05 e ##P <0,01 vs. gruppo MCAO/R).Inoltre, la colorazione TUNEL ha mostrato che l'apoptosi cellulare era esacerbata nei tessuti cerebrali dei ratti MCAO/R rispetto ai ratti sham (** P <0, 01).Il numero di cellule apoptotiche nei ratti MCAO/R è stato notevolmente ridotto dopo il trattamento con L-DHM, M-DHM e H-DHM in modo dose-dipendente (Figura 1D) (#P <0,05 e ##P <0,01 vs MCAO /gruppo R).Questi risultati hanno dimostrato che il trattamento con DHM ha alleviato la lesione cerebrale I/R nei ratti.Figura 1 Il trattamento con diidromiricetina ha alleviato il danno cerebrale I/R nei ratti.I ratti sono stati sottoposti a MCAO/R per indurre lesioni cerebrali I/R e quindi somministrati un trattamento con DHM a dosi crescenti.I topi operati con la finzione servivano da controlli.(A) I punteggi neurologici dei ratti.(B) Contenuto d'acqua nel cervello dei ratti.(C) Volume dell'infarto dei tessuti cerebrali valutato mediante colorazione TTC.(D) Le cellule apoptotiche nei tessuti cerebrali sono state esaminate mediante colorazione TUNEL.**P < 0,01, rispetto al gruppo sham.#P < 0,05, ##P < 0,01, rispetto al gruppo MCAO/R.Figura 1 Il trattamento con diidromiricetina ha alleviato il danno cerebrale I/R nei ratti.I ratti sono stati sottoposti a MCAO/R per indurre lesioni cerebrali I/R e quindi somministrati un trattamento con DHM a dosi crescenti.I topi operati con la finzione servivano da controlli.(A) I punteggi neurologici dei ratti.(B) Contenuto d'acqua nel cervello dei ratti.(C) Volume dell'infarto dei tessuti cerebrali valutato mediante colorazione TTC.(D) Le cellule apoptotiche nei tessuti cerebrali sono state esaminate mediante colorazione TUNEL.**P < 0,01, rispetto al gruppo sham.#P < 0,05, ##P < 0,01, rispetto al gruppo MCAO/R.Le figure 2A e B mostrano che SPHK1 era altamente espresso nei ratti MCAO/R rispetto ai ratti sham (** P <0, 01 vs gruppo sham).Il trattamento con DHM ha causato una down-regulation di SPHK1 nei ratti MCAO/R in modo dose-dipendente (##P <0,01 vs gruppo MCAO/R).L'espressione di mTOR non è cambiata in questi gruppi, mentre il livello di fosforilazione di mTOR è diminuito nei ratti MCAO/R dopo il trattamento con DHM in modo dose-dipendente (Figura 2A e C) (**P <0,01 vs gruppo sham e #P < 0,05 e ##P < 0,01 rispetto al gruppo MCAO/R).Inoltre, i livelli di espressione delle proteine ​​​​correlate alla ferroptosi e GPX4 erano significativamente diminuiti mentre i livelli di ACSL4 e PEBP1 erano aumentati nei ratti MCAO/R (**P <0,01 vs gruppo sham).Il trattamento con DHM ha migliorato l'espressione di GPX4 e ha ridotto l'espressione di ACSL4 e PEBP1 in modo dose-dipendente (Figura 2A e D-F) (#P <0,05 e ##P <0,01 vs gruppo MCAO/R).Questi dati hanno mostrato che il DHM ha soppresso la via SPHK1/mTOR e la ferroptosi nei ratti con lesione cerebrale I/R.Figura 2 La diidromiricetina ha represso l'espressione di SPHK1 e p-mTOR e ha ridotto la ferroptosi nei ratti con lesione cerebrale I/R.(A–F) I ratti sono stati sottoposti a MCAO/R per indurre lesioni I/R o seguiti da trattamento con L-DHM, M-DHM, H-DHM.I topi operati con la finzione servivano da controlli.Analisi Western blotting di SPHK1, p-mTOR/mTOR, GPX4, ACSL4 e PEBP1 nei tessuti cerebrali dei ratti.**P < 0,01, rispetto al gruppo sham.#P < 0,05, ##P < 0,01, rispetto al gruppo MCAO/R.Figura 2 La diidromiricetina ha represso l'espressione di SPHK1 e p-mTOR e ha ridotto la ferroptosi nei ratti con lesione cerebrale I/R.(A–F) I ratti sono stati sottoposti a MCAO/R per indurre lesioni I/R o seguiti da trattamento con L-DHM, M-DHM, H-DHM.I topi operati con la finzione servivano da controlli.Analisi Western blotting di SPHK1, p-mTOR/mTOR, GPX4, ACSL4 e PEBP1 nei tessuti cerebrali dei ratti.**P < 0,01, rispetto al gruppo sham.#P < 0,05, ##P < 0,01, rispetto al gruppo MCAO/R.La vitalità cellulare delle cellule HT22 è stata significativamente soppressa dopo il trattamento con OGD/R (** P <0, 01 rispetto al gruppo di controllo).Il trattamento con DHM a dosi di 10, 20 e 30 μM ha migliorato la vitalità cellulare delle cellule HT22 trattate con OGD/R, specialmente a una dose di 30 μM (Figura 3A) (#P <0,05 e ##P <0,01 vs OGD/ gruppo R e @P < 0,05 rispetto al gruppo 20-DHM).Inoltre, il trattamento con OGD/R ha notevolmente accelerato l'apoptosi nelle cellule HT22;questo è stato efficacemente salvato dal trattamento con DHM in modo dose-dipendente (Figura 3B) (**P <0,01 rispetto al gruppo di controllo e ##P <0,01 rispetto al gruppo OGD/R e @@P <0,01 rispetto al gruppo 20-DHM ).Poiché 30 μM di DHM hanno mostrato il miglior effetto inibitorio sull'apoptosi indotta da OGD/R nelle cellule HT22, questa dose è stata utilizzata per trattare le cellule HT22 in tutti gli esperimenti successivi.Questi risultati hanno mostrato che il DHM ha migliorato la vitalità cellulare e ha soppresso l'apoptosi nelle cellule HT22 trattate con OGD/R.Successivamente, abbiamo analizzato l'entità della ferroptosi nelle cellule HT22 trattate con OGD/R.Figura 3 La diidromiricetina ha migliorato la vitalità cellulare e l'apoptosi repressa nelle cellule HT22 trattate con OGD/R.Le cellule HT22 sono state sottoposte a OGD/R o pretrattate con 1, 10, 20 o 30 μM di DHM.Il test CCK-8 (A) e la citometria a flusso (B) sono stati eseguiti per rilevare la vitalità e l'apoptosi nelle cellule HT22.**P < 0,01, rispetto al gruppo di controllo.#P < 0,05, ##P < 0,01, rispetto al gruppo OGD/R.@P < 0,05, @@P < 0,01, rispetto al gruppo 20-DHM.Figura 3 La diidromiricetina ha migliorato la vitalità cellulare e l'apoptosi repressa nelle cellule HT22 trattate con OGD/R.Le cellule HT22 sono state sottoposte a OGD/R o pretrattate con 1, 10, 20 o 30 μM di DHM.Il test CCK-8 (A) e la citometria a flusso (B) sono stati eseguiti per rilevare la vitalità e l'apoptosi nelle cellule HT22.**P < 0,01, rispetto al gruppo di controllo.#P < 0,05, ##P < 0,01, rispetto al gruppo OGD/R.@P < 0,05, @@P < 0,01, rispetto al gruppo 20-DHM.Il trattamento con OGD/R ha causato un eccessivo accumulo di ROS lipidici e un aumento dei livelli di ferro intracellulare nelle cellule HT22 (**P <0,01 vs gruppo di controllo).Il trattamento con DHM ha limitato l'accumulo mediato da OGD/R di lipidi ROS e ferro intracellulare nelle cellule HT22 (# P <0, 05 vs gruppo OGD/R) (Figura 4A e B).I risultati del western blotting hanno mostrato che l'espressione di SPHK1 era notevolmente aumentata nelle cellule HT22 trattate con OGD/R, mentre l'espressione di SPHK1 è stata salvata in presenza di DHM (** P <0,01 rispetto al gruppo di controllo e ##P <0,05 rispetto al gruppo OGD/R ) (Figure 4C e D).L'espressione di mTOR non è cambiata nelle cellule HT22 dopo il trattamento con OGD/R o DHM.La fosforilazione di p-mTOR è stata significativamente ridotta nelle cellule HT22 trattate con OGD/R;questo è stato ulteriormente soppresso dal trattamento con DHM (** P <0,01 rispetto al gruppo di controllo e #P <0,05 rispetto al gruppo OGD/R) (Figura 4C ed E).Inoltre, i livelli di espressione di GPX4 sono stati ridotti, mentre i livelli di ACSL4 e PEBP1 sono stati migliorati nelle cellule HT22 trattate con OGD/R.Il trattamento con DHM ha portato a una sovraregolazione di GPX4 e una sottoregolazione di ACSL4 e PEBP1 nelle cellule HT22 trattate con OGD/R (**P <0,01 rispetto al gruppo di controllo e #P <0,05 rispetto al gruppo OGD/R) (Figura 4C e FA–H).Collettivamente, questi dati mostrano che il DHM ha efficacemente soppresso la via SPHK1/mTOR e la ferroptosi nelle cellule HT22 trattate con OGD/R.Figura 4 La diidromiricetina ha soppresso l'espressione di SPHK1 e p-mTOR e ha ridotto la ferroptosi nelle cellule HT22 trattate con OGD/R.Le cellule HT22 sono state sottoposte a OGD/R o pretrattate con 30 μM di DHM.Sono stati rilevati i livelli di ROS lipidico (A) e ferro intracellulare (B).(C–H) Analisi Western blotting di SPHK1, p-mTOR/mTOR, GPX4, ACSL4 e PEBP1 nelle cellule HT22.**P < 0,01, rispetto al gruppo di controllo.#P < 0,05, ##P < 0,01, rispetto al gruppo OGD/R.Figura 4 La diidromiricetina ha soppresso l'espressione di SPHK1 e p-mTOR e ha ridotto la ferroptosi nelle cellule HT22 trattate con OGD/R.Le cellule HT22 sono state sottoposte a OGD/R o pretrattate con 30 μM di DHM.Sono stati rilevati i livelli di ROS lipidico (A) e ferro intracellulare (B).(C–H) Analisi Western blotting di SPHK1, p-mTOR/mTOR, GPX4, ACSL4 e PEBP1 nelle cellule HT22.**P < 0,01, rispetto al gruppo di controllo.#P < 0,05, ##P < 0,01, rispetto al gruppo OGD/R.Il trattamento con OGD/R ha in particolare soppresso la vitalità cellulare e potenziato l'apoptosi nelle cellule HT22;questo è stato salvato dal trattamento con DHM (**P <0,01 rispetto al gruppo di controllo e ##P <0,01 rispetto al gruppo OGD/R. Il miglioramento della vitalità cellulare mediato dal trattamento con DHM e l'inibizione dell'apoptosi sono stati soppressi dal knockdown GPX4 (@P < 0,05 vs gruppo OGD/R+30-DHM+si-NC) (Figura 5A e B). Inoltre, i livelli di ROS lipidico e ferro intracellulare erano significativamente aumentati nelle cellule HT22 dopo il trattamento con OGD/R (**P <0,01 rispetto al gruppo di controllo). Gruppo OGD/R+30-DHM+si-NC) (Figura 5C e D).Inoltre, l'espressione GPX4 è stata regolata verso il basso mentre l'espressione ACSL4 e PEBP1 è stata regolata verso l'alto nelle cellule HT22 trattate con OGD/R (**P <0,01 rispetto al gruppo di controllo).Il deficit di GPX4 ha alterato la sovraregolazione mediata da DHM di GPX4 e la sottoregolazione di ACSL4 e PEBP1 nelle cellule HT22 trattate con OGD/R (##P <0,01 rispetto al gruppo OGD/R e @ P < 0,05 rispetto al gruppo OGD/R+30-DHM+si-NC) (Figura 5E–H).Collettivamente, questi dati indicavano che il DHM riduceva la ferroptosi nelle cellule HT22 trattate con OGD/R regolando l'espressione di GPX4.Figura 5 La diidromiricetina ha ridotto la ferroptosi nelle cellule HT22 trattate con OGD/R regolando l'espressione di GPX4.Le cellule HT22 sono state trasfettate con si-GPX4 o si-NC, seguite da OGD/R o combinate con 30 μM di trattamento DHM.Il test CCK-8 (A) e la citometria a flusso (B) sono stati eseguiti per rilevare la vitalità cellulare e l'apoptosi nelle cellule HT22.Sono stati rilevati i livelli di ROS lipidico (C) e ferro intracellulare (D).(E-H) Analisi Western blotting di GPX4, ACSL4 e PEBP1 nelle cellule HT22.**P < 0,01, rispetto al gruppo di controllo.##P < 0,01, rispetto al gruppo OGD/R.@P < 0,05, @@P < 0,01, rispetto al gruppo OGD/R+30-DHM+si-NC.Figura 5 La diidromiricetina ha ridotto la ferroptosi nelle cellule HT22 trattate con OGD/R regolando l'espressione di GPX4.Le cellule HT22 sono state trasfettate con si-GPX4 o si-NC, seguite da OGD/R o combinate con 30 μM di trattamento DHM.Il test CCK-8 (A) e la citometria a flusso (B) sono stati eseguiti per rilevare la vitalità cellulare e l'apoptosi nelle cellule HT22.Sono stati rilevati i livelli di ROS lipidico (C) e ferro intracellulare (D).(E-H) Analisi Western blotting di GPX4, ACSL4 e PEBP1 nelle cellule HT22.**P < 0,01, rispetto al gruppo di controllo.##P < 0,01, rispetto al gruppo OGD/R.@P < 0,05, @@P < 0,01, rispetto al gruppo OGD/R+30-DHM+si-NC.Il trattamento con DHM ha migliorato la vitalità cellulare e ha soppresso l'apoptosi nelle cellule HT22 trattate con OGD/R, sebbene la sovraespressione di SPHK1 e il trattamento con MHY1485 abbiano indebolito gli effetti del DHM (** P <0,01 rispetto al gruppo di controllo, ##P <0,01 rispetto al gruppo OGD/R e @P <0,05 vs OGD/R+30-DHM+gruppo vettoriale) (Figura 6A e B).Il trattamento con DHM ha anche ridotto i livelli di ROS lipidico e ferro intracellulare nelle cellule HT22 trattate con OGD/R;questi effetti sono stati aboliti dalla sovraespressione di SPHK1 o dal trattamento con MHY1485 (**P <0,01 vs gruppo di controllo, ##P <0,01 vs gruppo OGD/R e @P <0,05 e @@P <0,01 vs OGD/R+30-DHM +gruppo vettore) (Figura 6C e D).Inoltre, il Western blotting ha rivelato che l'espressione di SPHK1 era elevata mentre l'espressione di p-mTOR era ridotta nelle cellule HT22 trattate con OGD/R.Il trattamento con DHM ha causato una riduzione dell'espressione di SPHK1 e un'ulteriore riduzione dell'espressione di p-mTOR nelle cellule HT22 trattate con OGD/R (* P <0, 05 e ** P < 0, 01 rispetto al gruppo di controllo).Gli impatti del trattamento con DHM sull'espressione di SPHK1 e p-mTOR sono stati salvati dalla sovraespressione di SPHK1 o dal trattamento MHY1485 (##P <0,01 vs gruppo OGD/R e @@P <0,01 vs OGD/R+30-DHM+gruppo vettore) (Figura 6E–G).Il DHM ha soppresso la ferroptosi indotta da OGD/R nelle cellule HT22 inibendo la via di segnalazione SPHK1/mTOR.Figura 6 La diidromiricetina ha limitato la ferroptosi indotta da OGD/R inibendo la via di segnalazione SPHK1/mTOR.Le cellule HT22 sono state trasfettate con pcDNA3.1-SPHK1/Vector o trattate con MHY1485, seguite da OGD/R o combinate con 30 μM di trattamento DHM.Il test CCK-8 (A) e la citometria a flusso (B) sono stati eseguiti per rilevare la vitalità cellulare e l'apoptosi nelle cellule HT22.Sono stati rilevati i livelli di ROS lipidico (C) e ferro intracellulare (D).(E-G) Analisi Western blotting di SPHK1, p-mTOR/mTOR nelle cellule HT22.**P < 0,01, rispetto al gruppo di controllo.##P < 0,01, rispetto al gruppo OGD/R.@P < 0,05, @@P < 0,01, rispetto al gruppo OGD/R+30-DHM.Figura 6 La diidromiricetina ha limitato la ferroptosi indotta da OGD/R inibendo la via di segnalazione SPHK1/mTOR.Le cellule HT22 sono state trasfettate con pcDNA3.1-SPHK1/Vector o trattate con MHY1485, seguite da OGD/R o combinate con 30 μM di trattamento DHM.Il test CCK-8 (A) e la citometria a flusso (B) sono stati eseguiti per rilevare la vitalità cellulare e l'apoptosi nelle cellule HT22.Sono stati rilevati i livelli di ROS lipidico (C) e ferro intracellulare (D).(E-G) Analisi Western blotting di SPHK1, p-mTOR/mTOR nelle cellule HT22.**P < 0,01, rispetto al gruppo di controllo.##P < 0,01, rispetto al gruppo OGD/R.@P < 0,05, @@P < 0,01, rispetto al gruppo OGD/R+30-DHM.Il danno cerebrale I/R è uno dei principali meccanismi fisiopatologici dell'ictus ischemico.Nel presente studio, abbiamo verificato le funzioni e il meccanismo molecolare del DHM nella lesione cerebrale I/R.I risultati degli esperimenti in vivo hanno rivelato che il DHM ha ridotto efficacemente i deficit neurologici e le lesioni cerebrali dei ratti MCAO/R.Gli autori non segnalano conflitti di interesse in questo lavoro.Oxid Med Cell Longev.Tossico Lett.Oxid Med Cell Longev.Tutti i diritti riservati.